Variación de Áreas en HPLC – Causas, Soluciones y Buenas Prácticas

La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) es una de las técnicas más utilizadas en química analítica para la separación, identificación y cuantificación de compuestos en muestras complejas. Una de las metodologías más comunes para determinar la concentración de un analito es la comparación de las áreas bajo los picos cromatográficos.

La integración del área en un cromatograma HPLC es similar al cálculo de áreas bajo una curva gaussiana en estadística: requiere precisión y reproducibilidad para que los resultados sean confiables. Por ello, la reproducibilidad de áreas es un parámetro clave para evaluar el desempeño del sistema cromatográfico.

A nivel internacional, distintas farmacopeas y reguladores establecen que la variación de áreas no debe superar el 2.0 % de RSD (Desviación Estándar Relativa). Cuando este límite se excede, es señal de que el sistema presenta un problema que debe investigarse.

Principales Causas de Variación en Áreas en HPLC

Existen diferentes patrones de variación en las áreas cromatográficas, cada uno asociado a causas específicas:

1. Variación Aleatoria de Áreas

• Causas: Generalmente relacionada con errores de inyección. La presencia de aire en el inyector automático puede generar resultados inconsistentes.

  
  

• Solución: Purgar el sistema de inyección, revisar la hermeticidad y realizar calibraciones para asegurar inyecciones precisas.

  
  

2. Variación de Áreas con Tendencia a la Disminución

• Causas:

  • Degradación del analito por luz, temperatura o inestabilidad en solución.

  • Daños en la columna HPLC o en las válvulas del inyector.

  • Contaminación de la muestra o interacciones no deseadas con el solvente.

    
    

• Solución: Verificar la estabilidad del analito bajo distintas condiciones, revisar el estado de la columna e inyector, y garantizar que los solventes sean adecuados.

  
  

3. Variación de Áreas con Tendencia al Aumento

• Causas: Contaminación por arrastre de muestras previas o un sistema de lavado ineficiente. Las soluciones de lavado universales pueden ser insuficientes para analitos específicos.

  
  

• Solución: Utilizar solventes de enjuague compatibles con el analito y revisar el correcto funcionamiento del sistema de lavado del inyector.

  
  

Factores Adicionales que Influyen en la Variación de Áreas

Además de los patrones anteriores, existen otros factores que pueden afectar la cuantificación en HPLC:

• Condiciones del solvente: La pureza y compatibilidad del solvente influyen en la señal del detector y en la integridad del analito.

  
  

• Condiciones ambientales: Temperatura y humedad del laboratorio pueden afectar la estabilidad de la muestra.

  
  

• Calibración y mantenimiento del equipo: Una calibración inadecuada o mantenimiento deficiente ocasiona variaciones significativas y resultados poco confiables.

La variación de áreas en HPLC es un indicador crucial de la confiabilidad de un sistema cromatográfico. Desde errores aleatorios hasta problemas sistemáticos, las causas pueden ser múltiples, pero con una revisión ordenada de la muestra, el inyector, la columna y el detector, es posible identificar la raíz del problema.

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