Variación en el tiempo de retención en HPLC

El tiempo de retención es el periodo en el que eluye uno o más de los picos de interés, que se pueden visualizar en el cromatograma.

En general, la normativa vigente en cada país establece una tolerancia para la variación del tiempo de retención de ± 1.0 min, aunque puede haber diferencias según la región. Por lo tanto, si en un cromatograma se observa un pico “X” con un tiempo de retención de 4.7 minutos, se considera aceptable que este pico se desplace dentro de una ventana de 3.7 a 5.7 minutos sin que se interprete como un error en el análisis.

Para identificar la causa de un desplazamiento inusual en el tiempo de retención, se recomienda analizar el problema tomando en cuenta las siguientes preguntas:

• ¿Se siguió el método al pie de la letra?

• ¿La variación en el tiempo de retención afecta a todos los picos o solo a algunos?

• ¿Se observa un cambio en la forma del pico?

• ¿La variación es aleatoria, ocurre más temprano o más tarde?

Responder estas preguntas ayudará a aislar el problema y encontrar posibles soluciones.

Verificación del método

Lo primero es asegurarse de que el método analítico se haya seguido correctamente, sin cambios en la preparación de fases, diluyentes u otros insumos necesarios para el análisis. Aunque puede parecer básico, a veces se realizan modificaciones en métodos que no están diseñados para tolerar ciertos cambios o no se consideraron al realizar la robustez y cualquier alteración deliberada puede provocar desviaciones en los resultados.

Variaciones en todos los picos

Si el tiempo de retención cambia en todos los picos de un cromatograma (por ejemplo, cuando hay dos o más sustancias de interés en la mezcla), esto podría indicar un problema en la dinámica de fluidos. Según la naturaleza de la variación (si es aleatoria, siempre más temprano o siempre más tarde), se podría sospechar de cambios en la temperatura del laboratorio en métodos que no controlan adecuadamente la temperatura o en sistemas que tienen un compartimento de columnas a una temperatura inadecuada.

También podría haber una fuga en el sistema o una obstrucción en algún filtro de solvente. Si el tiempo de elución es consistentemente mayor, es posible que exista un problema con la dosificación del flujo, lo que indicaría que el flujo dispensado por el equipo de HPLC es menor al programado. Además, una fase móvil con errores en la proporción podría alterar el tiempo de retención de los picos, por lo que es esencial conocer el mecanismo de separación que se está utilizando en el método.

Cambios en la forma del pico

Si, además de observar variaciones en el tiempo de retención, también hay deformación del pico (por ejemplo, cola o ensanchamiento de la banda), esto puede deberse a un aumento en el volumen muerto extracolumnal. Esto podría originarse por un aumento en la longitud o en el diámetro interno de la línea entre la salida de la columna y la entrada del detector, o debido a un cambio de equipo, que puede incluir líneas de mayor longitud o diámetro interno.

Daño en la columna

Otra posibilidad es que la columna esté dañada de forma irreversible. Esto puede ocurrir si los puntos activos de la columna han disminuido significativamente o si se ha producido una desfuncionalización de las cadenas, dejando el soporte expuesto.

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