Picos Muy Pequeños en HPLC – Causas, LOD, LOQ y Soluciones

En cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y en cromatografía de gases (GC), los analistas buscan separar, identificar y cuantificar compuestos de interés. Para lograrlo, es fundamental obtener picos cromatográficos de buen tamaño, ya que picos muy pequeños en HPLC suelen ser incuantificables o incluso indetectables.

¿Cómo saber si un pico en HPLC es demasiado pequeño?

Los organismos reguladores establecen criterios basados en la relación señal/ruido (S/N):

• Límite de Detección (LOD): Un pico se considera detectable si la relación señal/ruido es S/N ≥ 3 y es reproducible en al menos tres mediciones.

  
  

• Límite de Cuantificación (LOQ): Para que un pico sea cuantificable con confiabilidad, la relación debe ser S/N ≥ 10, también reproducible en múltiples mediciones.

  
  

📌 Nota: Según guías regulatorias como ICH, el LOD y el LOQ también pueden calcularse con base en el error estándar de una curva de calibración, aunque en la práctica muchos softwares de cromatografía calculan automáticamente la relación S/N.

¿Por qué aparecen picos muy pequeños en HPLC?

Si tu cromatograma muestra picos demasiado pequeños, el problema puede deberse a dos factores principales:

1. Ruido excesivo en la línea base.

   
   

2. Señal insuficiente del analito.

   
   

Estrategias para Reducir el Ruido en HPLC

• Seleccionar una longitud de onda adecuada, minimizando interferencias.

  
  

• Verificar la pureza de solventes, aditivos y reactivos. Solventes con absorción UV <230 nm pueden aumentar el ruido.

  
  

• Evitar contaminación en reactivos que genere señales de fondo.

  
  

• Controlar las condiciones ambientales, ya que vibraciones y cambios de temperatura elevan el ruido.

  
  

• Mantener la celda del detector limpia. Aplica también a detectores distintos de UV (RI, EQ, etc.).

  
  

• Programar mantenimiento y calibraciones regulares del detector.

  
  

Estrategias para Aumentar la Señal del Analito

• Seleccionar un detector más adecuado (UV/Vis, RI, fluorescencia, etc.).

  
  

• Utilizar una columna con menor diámetro interno (ajustando el método).

  
  

• Usar columnas de menor tamaño de partícula (considerando el aumento de presión).

  
  

• Ajustar el caudal de fase móvil para optimizar la elución del analito.

  
  

• Inyectar mayor cantidad de analito, ya sea aumentando la concentración o el volumen de inyección (si el método lo permite).

  
  

Los picos muy pequeños en HPLC pueden comprometer la detección y cuantificación de analitos, afectando la confiabilidad del método. Con un enfoque sistemático, ya sea reduciendo el ruido de fondo o aumentando la señal, es posible mejorar significativamente la sensibilidad del análisis.

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